本期为大家总结了，在诱导MC3T3-E1细胞过程中的注意事项和具体操作步骤。

1. 细胞的培养

   培养条件

培养基：MEM α +10%胎牛血清+1%双抗（注意：MEM α 不含VC组分） 

推荐传代比例：1：4-1：8

换液频率：  2-3次/周 2-3次/周

培养条件： 5% CO₂，37°C

2 成骨诱导分化实验步骤

①由于诱导时间比较长，建议提前使用明胶包被6孔板。（注意此处是为了减少诱导过程细胞漂起、不贴壁）

②建议取第3~5代、纯度达90%以上、状态良好的MC3T3-E1细胞，将其消化下来，离心收集，使用MC3T3-E1细胞完全培养基调整细胞密度为1~5×105个cell/mL，均匀铺于6孔板中，每孔2mL，置于37℃恒温细胞培养箱中培养。（注意：此处细胞密度及培养液体积以6孔板为例，若为其它培养器皿，请根据实际情况调整细胞密度及培养液体积。）

③待细胞汇合度达80%~100%时，即可进行诱导分化。

④小心吸弃细胞培养上清，沿孔壁缓慢加入提前配制好的诱导分化完全培养基，每孔2mL，置于37℃恒温细胞培养箱中培养。（注意：完全培养基加入细胞前需提前置于37℃预热。）

⑤每2day换用新鲜的诱导分化完全培养基。由于细胞量比较大，培养液颜色会偏黄色属于正常现象，及时换液即可。（注意：完全培养基加入细胞前需提前置于37℃预热。）

⑥细胞诱导3周后，即可进行茜素红染色鉴定。

⑦诱导过程中，已经成骨的MC3T3-E1细胞会变褐色和变圆。

3.鉴定方法

A.茜素红染色分析

① 细胞诱导分化结束后，小心吸弃细胞培养上清，1×PBS润洗1~2次。每孔加入1mL细胞固定液（4%中性甲醛溶液等），室温固定15-30 min。（注意：操作一定要轻柔。）

② 吸弃细胞固定液，1×PBS润洗2次。沿孔壁缓慢加入茜素红染色液，每孔1mL，室温染色30min。（注意：染色液底部可能会有沉淀，吸取时尽量不要触及底部。若细胞染色后有沉淀，1×PBS洗去即可。）

③ 吸出染色液，1×PBS润洗，去掉浮色。显微镜下观察细胞染色效果，钙盐呈较深的橙红色。

④光镜拍照建议留一些pbs,减少光圈的出现，以便呈现更好的成骨效果。

B.成骨相关转录因子

矿化亚克隆选择性表达成骨细胞标志物、骨唾液蛋白 （BSP）、骨钙素 （OCN） 碱性磷酸酶（ALP） 骨桥蛋白（OPN）、I型胶原（COL I）和甲状旁腺激素 （PTH）/甲状旁腺激素相关蛋白 （PTHrP） 受体的 mRNA。相关引物序列如下

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