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干货分享—细胞的基因转染(一)

1.基因转染技术原理:

将特定的遗传信息传递到真核细胞中,这种能力不但革新了生物学和医学中许多基本问题的研究,也推动了诊断和治疗方面的分子技术发展,并使基因治疗成为可能。目前基因转移技术已广泛用于基因的结构和功能分析、基因表达与调控、基因治疗与转基因动物等研究。


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2.基因转移的病毒的方法

作为基因转移的递送工具,病毒载体的优点有:(1)在转化的细胞中传播重组的DNA分子作为稳定的遗传成分;(2)可将有制陷的或突变的基因置于病毒调节信号的控制下以进行研究;(3)能将克隆的基因作为病毒微染色体的一部分 ,并能进行分离;(4)转移效率较高。其主要缺点是病毒载体对外源基因容纳量不够。目前常用的病毒载体有下列几种:

逆转录病毒载体 逆转录病毒为RNA病毒,它们的基因组编码在一条单链RNA上,病毒进入细胞通过逆转录作用,病毒RNA即转变为双链DNA分子,DNA进入细胞核并整合在细胞染色体中,这种整合的病毒称为原病毒。在原病毒的两端各有一长末端重复序列(LTR,LTR内侧还有为复制所必需的其他顺序,包括包装信号。目前常用的逆转病毒载体有CMVSV

DNA病毒载体 主要有腺病毒相关病毒载体,腺端正毒载体,疱疹病毒载体。对DNA病毒载体的研究是当前基因治疗研究中的重点领域。

3.常用的基因转染技术

将外源基因导入靶细胞需要一定的载体和导入方法,基因转技术则是将纯化的含有靶基因的质粒DNA送入细胞内,并在细胞内表达。转染方法有多种,根据不同的细胞,贴壁或悬浮细所可选用不同的方法,其目的是要达到设置转染效率,影响转染产率的因素有多种,包括转染方法、操作技术、质粒DNA的纯度、靶细胞的生长状态等,下面重点介绍向几种常用的转染技术:

靶细胞的准备 被用于作靶基因转染的细胞,其生长状态如何,将直接决定了基因转染效率。如为贴壁生长的细胞,一般要求在转染前一日,必需应用胰酶处理成单细胞悬液,重新接种于培养皿或瓶,细胞密度以铺满培养器皿的60%为宜,转染当日,在转染前4小时换一次新鲜培养液。对于悬浮细胞,也需在转染前4小时换一次新鲜培养液。

靶基因质粒DNA的准备 用于转染的质粒DNA必须无蛋白质,无RNA和其化学物质的污染,OD260/280比值应在1.8以上。应用酚-氯仿抽提法制备的质粒DNA一般难以达到此标准,目前大多采用提取纯化试剂盒。

具体的基因转染技术有鳞酸钙介导的转染法、DEAE葡聚糖介导转染法、脂质体介导转染法及电击基因转导尘等。靶基因被导入细胞后,一般在转染后48小时,靶基因即在细胞内表达。根据不同的实验目的,48小时后即可进行靶基因表达的检测等实验。如若建立稳定的细胞系,则可对靶细胞进行筛选,根据不同基因载体中所含有的抗性标志选用相应的药物,最常用的直核表达基因载体的标志物有潮霉素(hygromycin)和新霉素(neomycin)。

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