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基因突变的检测方法(一)

      基因突变的研究已成为当今生命科学研究的热点之一,检测方法也随之迅速发展。对于基因突变的检测,1985以前,利用Southern印迹法,可以筛选出基因的缺失、插入和移码重组等突变形式。对于用该法不能检测的突变,只能应用复杂的DNA序列测定分析法。其中多聚酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术是突变检测中重大进展,目前几乎所有的基因突变检测的分子诊断技术都是建立于PCR的基础之上,并且由PCR衍生出许多的新方法,目前已达二十余种,自动化程度也愈来愈高,分析时间大大缩短,分析结果的准确性也有很大的提高。其中包括单链构象多态性(single-strand comformational polymorphism,SSCP)和异源双链分析法(heteroduplex analysis,HA)。下面分别介绍几种PCR衍生技术及经典突变检测方法,可根据检测目的和实验室条件选择时参考。


中乔新舟 生物科技 细胞培养方法 原代细胞和细胞系的差别 生物技术 PCR-SSCP HA 基因突变

PCR-SSCP法



它主要应用在非聚丙烯酰胺凝胶上,短的单链DNA和RNA分子依其大小基序列不同而形成不同构象,一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶上的移动速度改变。其基本原理为单链DNA在中性条件下会形成二级结构,这种二级结构依赖于其碱基组成,即使一个碱基的不同,也会形成不同的二级结构而出现不同的迁移率。由于该法简单快速,因而被广泛用于未知基因突变的检测。用PCR-SSCP法检测小于200bp的PCR产物时,突变检出率可达70%-95%,片段大于400bp时,检出率仅为50%左右,该法可能会存在1%的假阳性率。应用PCR-SSCP法应注意电泳的良好条件,一般突变类型对检测的灵敏度无大的影响,同时该法不能测定突变的准确位点,还需通过序列分析来确定。对于大于200bp的片段,用其RNA分子来做SSCP会提高其录敏度。应用PCR-SSCP检测点突变已见报道于人类大部分的肿瘤组织或细胞,如乳腺癌、食管癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌等。检测的基因包括多种癌基因及抑癌基因,也是检测抑癌基因p53突变常用的方法,仅检测第5-8外显子即可发现85%以上的p53基因突变。由于该法简便快速,特别适合大样本基因突变研究的筛选工作。


异源双链分析法(HA)



HA法直接在变性凝胶上分离杂交的突变型一些野生型DNA双链。由于突变和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成一突起,在非变性凝胶中电泳时,会产生与相应的同源双DNA不同的迁移率。该法与SSCP相似,不同的是SSCP分离的是单链DNA,HA法分离的是双链DNA,也只适合于小片段的分析。但HA对一些不能用SSCP检出的突变有互补作用,两者结合使用,可使突变检出率提高到近100%。


突变体富集PCR法(mutant-enriched PCR)



本法的基本原理是利用ras基因家族某个密码子部位存在已知的限制性内切酶位点,如K-ras基因位12密码子的BstNI位点,位13密古巴子有BgⅠⅡ位点。用连续二次的巢式PCR来扩增包括K-ras位12、13密码子的DNA片段,在两次扩增反应之间用相应的内切酶消化扩增的DNA片段,野生型因被酶切而不能进入二次PCR扩增,而突变型则能完整进入二次PCR扩增并得到产物的富集。


变性梯度凝胶电泳法(denaturing gradinent electrophoresis,DGGE)



DGGE法旨在分析PCR产物,如果突变发生在解链的DNA区域,检出率可达100%,检测片段可达1kb,适围为100bp-500bp。基本原理基于当双链DNA在变性梯度凝胶中进行到与DNA变性湿度一致的凝胶位置时,DNA发生部分解链,电泳适移率下降,当解链的DNA链中有一个碱基改变时,会在不同的时间发生解链,因影响电泳速度变化的程度而被分离。由于本法是利用温度和梯度凝胶迁移率来检测,需要一套专用的电泳装置,合成的PCR引物在5`末端加一段40bp-50bp的GC夹,以利于检测发生于高熔点区的突变。在DGGE的基础上,又发展了用湿度梯度代替化学变性剂的TGGE法(温度梯度凝胶电泳temperature gradient gelelectrophoresis,TGGE)。DGGE和TGGE均有商品化的电泳装置,该法一经建立,操作也较简便,适合于大样本的检测筛选。


化学切割错配法(chemical cleavage of mismatch,CCM)



CCM为在Maxam-Gilbert测序法的基础上发展的一项检测突变的技术,其检测突变的准确性可与DNA测序相仿。其基本原理为将待测含DNA片段与相应的野生型DNA片段或DNA和RNA片段混合变性杂交,在异源杂合的双链核酸分子中,错配的C能被羟胺或哌啶切割,错配的T也能被切割,经变性凝胶电泳即可确定是否存在突变。该法检出率很高,也是检片段长的方法,已有报告检测了1.7kb片段,如果同时对正、反义链进行分析,检出率可达100%。应用荧光检测系统可增强敏感度,可检测到10个细胞中的1个突变细胞。因该法中的化学试剂有毒,又发展了碳二亚胺检测法(catodiimide,CDI),CDI为无毒物质,也可检测大片段DNA的点突变。


等位基因特异性寡核苷酸分析法(allele-specific oligonucleotide,ASO)



ASO为一种以杂交为基础对检测已知突变的检测技术。以PCR和ASO相结合,设计一段20bp左右的寡核苷酸片段,其中包含了发生突变的部位,以此为探针,与固定在膜上的经PCR拉增的样品DNA杂交。可以用各种突变类型的寡核苷酸探针,同时以野生型探针为对照,如出现阳性杂交带,则表明样品中存在与该ASO探针相应的点突变,ASO需严格控制杂交条件和设置标准对照避免假阳性和假阴性。目前已被商品化,有检测盒检测部分癌基因ASO突变。



(摘自生物谷,未完待续)




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