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人诱导多能干细胞培养实战指南!

 

细胞名称:hiPS 人诱导多能干细胞

描述:诱导性多能干细胞(Induced pluripotent stem cells,iPSCs ) 技术是指通过导入特定的转录因子将终末分化的体细胞重编程为多能性干细胞。ips 细胞的出现,在干细胞研究领域、表观遗传学研究领域以及生物医学研究领域都引起了强烈的反响。采用仙台病毒介导的外源转录因子导入,将人脐带血单核细胞诱导成 iPs 细胞。重编程转录因子:OCT4SOX2KLF4MYC该细胞每管含有细胞数>5x10^5 cells/ml,此细胞通过免疫荧光染色验证,经测试不含有 HIV-1HBVHCV、支原体、细菌、酵母和真菌。

种属:人

性别:女

组织来源:脐血来源

形态:克隆状

培养特性:贴壁

 

细胞复苏:

1. 六孔板事先包被好。操作 :包被液 Vitronectin (VTN-N)100X ,根据用量用不含钙 镁的 DPBS 稀释后每孔加 1-1.25ml 包被液 ,用封口膜封上 ,放 4 度冰箱过夜后使用。包被好的六孔板可以在 4 度冰箱存放 2 个星期 ,用之前 37 度回温。

2. 配置完全培养基按 14 比例混合 ,回温。

3. 取一个细胞冻存管,一个细胞冻存管可复苏六孔板的 1 个孔。

4. 准备 4 毫升的 medium ,加入 1 毫升细胞冻存液 ,1500rpm 3 分钟。

5. 准备复苏专用培养基 :全培养基 6mL 中加入终浓度是 10uM 的压制剂 Y27632(母 液浓度为 10mM 11000 稀释) ,充分混匀。

6. 离心后去上清 ,加入复苏专用培养基 6ml ,铺 3 个孔 ,次日换成不加压制剂 Y27632 的完全培养基( Note 5 )。

每天换液:细胞密度比较稀的时候每孔换液 1.5ml ,细胞密度较 浓或培养基颜色变黄时 ,每孔换液 2 毫升 ,细胞密度很浓时每孔换液 3 毫升 ,换液的时 候吸旧培养基轻吹孔底 1-2 次 ,完全吸走旧的培养基 ,加入新的培养基。

 

细胞传代:

生长的细胞当克隆变得较大而与相邻的克隆开始融合时 ,这时可进行传代。

1.配置完全培养基( Note 2 Note 3 ):培养基和 5X 补充剂按照体积比 4:1 的量 混合 ,RT 回温。事先包被 6 孔板。

2.吸掉完全 medium ,加入 1ml/孔的 ReleS RT 3 分钟。

3.准备包被孔 ,将包被液吸出 ,加入 1.5ml 新鲜完全培养基。

4.用从孔边缘吸掉 ReleS ,细胞仍然成片 ,只是不贴附在孔底 ,加入 1ml 的完全培养基 , 吹匀吹散细胞 ,吸取一定量的细胞液 ,按照一定稀释比例加入到新包被好的装有新鲜完 全培养基的孔中。加入细胞液后用枪立刻轻吹一次混匀 ,防止细胞局部密度过于大。

:稀释比例根据传的代数而定。初次传代 1:3 ,其次传代 1:6 ,再次传代 1:9 ,第 4 次传代 1:12 ,第 5 次传代 1:15

5.每天换液 :细胞密度比较稀的时候每孔换液 1.5ml ,细胞密度较浓时每孔换液 2 毫升 , 细胞密度很浓时每孔换液 3 毫升 ,换液时吸旧培养基轻吹孔底 1-2 次 ,吸走旧培养基和 悬浮的死细胞 ,加入新的培养基。

 

细胞冻存:

1. 吸掉完全 medium ,加入 1ml/孔的 ReleS RT 3 分钟;

2. 洗掉所有 ReleS ,加入冻存液( 10%DMSO in FBS ),吹匀后1毫升/冻存管 , -80 度冷冻保存。

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