一、细胞到货接收处理

1. 收到15 mL离心管发货细胞:将离心管竖直放入培养箱稳定30 min后，离心管配平800-1000 rpm，离心3-5 min，弃掉上清，细胞沉淀用1 mL完全培养基重悬，进行细胞计数记录活细胞量，按照2–3×10⁵ cells/ mL（具体可参考说明书）细胞量接种至T25培养瓶中，竖直培养，让细胞有恢复空间，后续根据细胞生长情况选择补液，传代或半换液（适用于聚团生长的细胞）。

2. 收到T25瓶发货细胞：先置于显微镜下拍照留存细胞原始状态；将细胞瓶水平静置5–10 min，再分别拍摄低倍镜（4×）、高倍镜（10×、20X）照片或视频，作为到货原始记录，拍照完成后，细胞培养瓶保持瓶口朝上竖瓶静置2–4 h，使悬浮细胞自然沉降至瓶底，减少操作过程中细胞损伤。静置稳定后，准备两个无菌、无酶、无热源50 mL离心管备用；使用5 mL移液枪缓慢吸取培养上清，保留瓶底约4 mL培养基和大部分细胞。吸取的上清转移至离心管，1000 rpm离心5 min。离心结束后，取3 mL新鲜完全培养基重悬细胞沉淀，转移回原细胞瓶，此时瓶内总体积约7 mL。到货细胞建议稳定培养24 h后，再评估状态进行传代操作。

二、细胞传代操作时要点

1. 传代前进行细胞计数：轻柔吹打细胞瓶2-3次混匀细胞悬液，吸取200微升细胞悬液至无菌EP管，轻柔吹散后计数，同时镜下观察细胞活率、碎片情况，判断是否满足传代条件。

2. 若细胞密度偏低、状态一般，可先补加1-2 mL新鲜完全培养基，旋松瓶盖放入培养箱过夜培养，次日观察培养基颜色并复测细胞密度。

3. 首次传代优先采用分液传代，不建议离心处理；少量细胞碎片无需过度处理，优先保障细胞扩增。常规每7天左右低速离心（800 rpm，3 min）清理碎片一次，无需频繁离心。

4. 日常培养重点观察培养基颜色：培养基未变黄时，每日镜检观察细胞形态与密度即可。

5. 当细胞量不足且培养基变黄需要换液时，优先选择补液法，其次采用半换液；常规维持每7天一次离心清理，尽量减少频繁离心对细胞造成应激损伤。

三、悬浮细胞分液传代，补液/半换液的标准操作

1.分液传代（以T25瓶，培养体积8 mL为例）

取样计数后，细胞活率密度满足传代条件，将T25瓶中的培养液吹打均匀，吸出4 mL培养基，转移至一个新的T25瓶，原瓶和新的T25瓶各补充4 mL培养基，放入培养箱继续培养观察。

2.补液法操作

每2-3天添加适量（1-2 mL）新鲜完全培养基；连续补液2–3次后，若细胞密度依旧偏低，再切换为半换液方式。

3.半换液操作（多适用于聚团生长的细胞，如NK-92，jurakt等）

竖直静置细胞瓶，静置前轻轻拍打瓶壁，使贴附瓶底的细胞团悬浮；静置10-15分钟，等待细胞自然沉降，肉眼可见清晰细胞沉淀层，小心缓慢吸出5 mL上层培养基（总体积为10 mL情况），转移至无菌离心管，1000 rpm离心5 min，确认离心管底部是否存在细胞沉淀，避免细胞丢失，原培养瓶内补入5 mL新鲜完全培养基；若离心管内收集到细胞沉淀，使用少量新鲜培养基重悬沉淀，转移回原培养瓶继续培养。