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DNA怎么裂解?裂解的试剂主要有哪些?

      裂解方法包括化学裂解、酶裂解和机械裂解。化学裂解和酶裂解通常是比较温和的方法,通常会很少使DNA 断裂。这几种方法是提取纯化DNA中常用的方法。机械裂解可以更均一的裂解细胞,同化学裂解相比,机械处理具有更高的裂解效率和更低的选择性。机械处理可以更剧烈和完整的裂解细胞,但也会造成DNA 的断裂.


一、机械裂解法主要有以下两种: 


      1.  热休克(Thermal shock),既反复冻溶法,是一种常用的机械裂解方式比,通常由冷冻和解冻两部分组成(freezing and thawing),。原理:由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀,使细胞结构破碎。冷冻通常在液氮或-20 ℃冰上进行,解冻可以在37、50、65 或100 ℃水浴中进热休克比化学裂解温和,但是很有效,有资料表明用热休克和溶菌酶与SDS的方法获得了90%的细胞裂解率。  

     2.  超声波处理(Ultrasonication)既利用超声加热的方法,把细胞破碎。但这种处理会导致DNA 的断裂,所以加热不宜过剧烈,要设定好超声时间和间隙时间,一般超声时间不超过5秒,间隙时间要大于超声时间,这些都有利于保护酶的活性。bead-beating 也是常用的机械处理方式,有报道指出bead-beating 比热休克和化学裂解的细胞裂解效果更好 虽然DNA产量较高,但通常得到的DNA片段较小。  


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二、 化学裂解和酶裂解法(在提核酸时联合使用)  主要是裂解液处理法,细胞裂解液的主要目的有以下几种:  


(1)利用去污剂破坏脂质双分子层,破裂细胞;  

(2)溶解蛋白;  

(3)蛋白变性使其稳定;  

(4)压制蛋白酶活性。  


      细胞裂解中常用的试剂有:  50 mM Tris-HCl pH 7.4(缓冲体系),150 mM NaCl(等渗体系),1 mM PMSF (强大的蛋白酶压制剂),1 mM EDTA(变性剂和稳定剂),5 µg/ml Aprotinin(蛋白酶压制剂),5 µg/ml Leupeptin(蛋白酶压制剂),1% Triton x-100(破坏细胞),1% Sodium deoxycholate(中度变性剂和蛋白溶解剂),0.1% SDS(强变性剂和蛋白溶解剂)。7M 尿素,2M硫脲(可以提高膜蛋白的融解),蛋白酶K等. 也可以直接在我司购买ScienCell实验室DNA、RNA、原代细胞裂解物 等,无需进行繁琐的细胞培养和裂解,到手就可以上实验,做这方面实验的您,会心动吗?




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